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常見(jiàn)細(xì)胞污染類型如何辨別及預(yù)防解決方法

發(fā)布時(shí)間:2024-05-28 10:09:48 細(xì)胞資源庫(kù)平臺(tái)

細(xì)胞污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)、最棘手的問(wèn)題,在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常時(shí),一定要及時(shí)排查污染并進(jìn)行處理,否則會(huì)給我們的實(shí)驗(yàn)造成極大的影響。細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的生物污染類型有7種,分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲(chóng)污染、黑膠蟲(chóng)污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染。

常見(jiàn)細(xì)胞污染類型如何辨別及預(yù)防解決方法

常見(jiàn)細(xì)胞污染類型

1. 真菌污染

污染來(lái)源:一般是來(lái)自實(shí)驗(yàn)服,并且具有氣候性,多雨、氣候濕潤(rùn)的季節(jié)容易出現(xiàn)。

污染培養(yǎng)細(xì)胞的真菌種類很多,常見(jiàn)的主要有:曲霉菌、黑曲霉、毛霉、白色念球菌、孢子菌、酵母菌等。

真菌肉眼下圖片

污染特征:真菌形態(tài)各異,但污染后均不難發(fā)現(xiàn),真菌污染一般肉眼可見(jiàn),肉眼下可觀察到培養(yǎng)液中有淡黃色或是白色的點(diǎn)狀漂浮物,短期內(nèi)培養(yǎng)基一般不變混濁。倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞之間有絮狀交錯(cuò)的菌絲或菌團(tuán),在高倍鏡下可以看見(jiàn)鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形,散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。細(xì)胞被污染后仍可生長(zhǎng),長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會(huì)變差。

呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見(jiàn)的菌落,培養(yǎng)基顏色無(wú)變化或變紫,僅對(duì)局部細(xì)胞影響較大,其他地方生長(zhǎng)正常。會(huì)形成孢子,容易污染其他細(xì)胞。

霉菌圖片

酵母菌圖片

1.2處理方法

真菌污染可以嘗試使用兩性霉素B進(jìn)行處理,抑制真菌生長(zhǎng),在PBS潤(rùn)洗、換液后可加入兩性霉素B(注意兩性霉素B有細(xì)胞毒性,使用后可能會(huì)有副作用),也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng),污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代。但真菌污染一般難以根除,若非必要,建議消殺后丟棄,對(duì)細(xì)胞房、培養(yǎng)箱、操作臺(tái)以及器皿和培養(yǎng)液等進(jìn)行全面消毒。

真菌污染可以嘗試使用兩性霉素B進(jìn)行處理,抑制真菌生長(zhǎng)。

1.3真菌預(yù)防

真菌污染屬于微生物污染,預(yù)防主要從空氣、器材、操作、血清入手。

a.減少空氣流動(dòng),培養(yǎng)室和操作室要注意空氣的消毒,工作時(shí)要戴口罩。

b.細(xì)胞培養(yǎng)器材消毒要徹底,盡可能的做到定期消毒,大概一周一次,若培養(yǎng)液漏出,則應(yīng)立即消毒。

c. 實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)有無(wú)菌觀念,動(dòng)作要符合規(guī)范,不使用污染的器具,瓶蓋應(yīng)封緊。

d. 血清生產(chǎn)和使用時(shí)可能受到污染,在使用前最好先檢查血清是否被污染,使用過(guò)程中也要保證不被污染。

2. 細(xì)菌污染

污染來(lái)源:操作不規(guī)范或無(wú)菌措施不到位等。

細(xì)菌特征圖片

常見(jiàn)菌種:常見(jiàn)的細(xì)菌污染有大腸埃希菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等。細(xì)菌污染后,培養(yǎng)液在短期內(nèi)會(huì)變黃色,因?yàn)橛写罅克嵝晕镔|(zhì)產(chǎn)生,而且會(huì)發(fā)生渾濁。

污染特征:顯微鏡下可觀察到大小不一(0.5~5μm)的物質(zhì),比細(xì)胞小很多,低倍鏡下呈沙粒狀布滿細(xì)胞間隙或培養(yǎng)基,高倍鏡下多呈球狀或桿狀,形態(tài)規(guī)則,分布均勻,鏡下觀察有明顯的定向運(yùn)動(dòng);增殖速度快,一般污染后48~72h爆發(fā)式增殖;營(yíng)養(yǎng)消耗快,培養(yǎng)基pH發(fā)生變化,顏色很快變黃,變渾濁,甚至可能有明顯的異味;細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,形態(tài)發(fā)生改變甚至脫落死亡。

細(xì)菌圖片

2.1處理方法

輕度污染或細(xì)胞比較珍貴:可用10~20×雙抗清洗處理。吸出培養(yǎng)基,以PBS清洗2~3遍,加胰酶消化至細(xì)胞形態(tài)略有變化但未脫離容器底部,加PBS輕輕潤(rùn)洗1次后加入20×高濃度雙抗浸泡細(xì)胞3~5min,棄雙抗;加入含10×雙抗的無(wú)污染完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)12h后正常傳代,并仍以含10×雙抗的完培進(jìn)行培養(yǎng),若第二代鏡下未觀察到細(xì)菌,第三代則可用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),傳代48h后無(wú)反彈認(rèn)為污染已清除。

重度污染建議直接消殺丟棄后對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行徹底消毒。為預(yù)防細(xì)菌感染,建議日常培養(yǎng)基中正常添加雙抗。

細(xì)菌污染后大多能改變培養(yǎng)液 pH 培養(yǎng)液變混濁,毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,根據(jù)感染細(xì)菌的不同,可有不同的外形,培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。

處理方法:輕度污染可用10X雙抗清洗處理,重度污染建議消殺后丟棄

3. 支原體污染

支原體污染:支原體(Mycoplasma)是一種沒(méi)有細(xì)胞壁的原核生物,大小約 0.3 - 0.8 微米。目前,已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有 100 多種。 由于支原體直徑較小,經(jīng)??梢源┻^(guò)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的 0.20 微米孔徑的除菌濾膜,高壓過(guò)濾時(shí),甚至可以穿過(guò) 0.10 微米孔徑的除菌濾膜,造成細(xì)胞的支原體污染。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,支原體感染發(fā)生率達(dá)到 63%,因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題。當(dāng)細(xì)胞(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染后,細(xì)胞內(nèi)的 DNA、RNA 及蛋白表達(dá)發(fā)生改變,而細(xì)胞的生長(zhǎng)率一般并未發(fā)生顯著的影響,因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺(jué)。

支原體圖片

污染來(lái)源:血清、胰酶、已污染物的氣溶膠、操作人員的口腔及皮膚等。

常見(jiàn)種類:口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無(wú)膽甾支原體等。直徑約為 0.1~0.3 μm,具有變形能力,可通過(guò)過(guò)濾膜(0.22-0.45 μm)。

污染特征:最小的微生物,無(wú)法通過(guò)光學(xué)顯微鏡看見(jiàn),但可通過(guò)電鏡觀察到。感染支原體的細(xì)胞,在某一時(shí)間點(diǎn)碎片突然增多,隨著傳代,細(xì)胞狀態(tài)顯著變差。細(xì)胞增殖減慢,鏡下觀察碎點(diǎn)變多、細(xì)胞邊界變得模糊、形態(tài)異常(拉絲、鋪展)、胞漿出現(xiàn)小顆粒或空泡,狀態(tài)越來(lái)越差;培養(yǎng)條件未變,培養(yǎng)基清澈;更換新的培養(yǎng)液,細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有恢復(fù)。支原體污染可通過(guò)氣溶膠傳播,影響同一細(xì)胞房其他細(xì)胞。

3.1支原體鑒定方法

鑒定方法:分離培養(yǎng)法、PCR法、ELISA、DNA熒光染色法、電鏡等。

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的細(xì)胞,呈高度多形性,細(xì)胞培養(yǎng)中被支原體污染是比較常見(jiàn)的問(wèn)題,因?yàn)槲廴緛?lái)源太多,包括工作環(huán)境、操作者、血清、實(shí)驗(yàn)器材等,鑒定的方法如下。

a. 相差顯微鏡觀察。其中可以采用直接觀察或地衣紅染色觀察,直接觀察時(shí),位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間的暗色微小顆粒為支原體,但要與線粒體區(qū)分。

b. 熒光染色法。將細(xì)胞接種于蓋玻片上,在細(xì)胞未長(zhǎng)滿前取出玻片,用不含酚紅的Hank's液漂洗后,再用1:3醋酸甲醇固定10min,然后用生理鹽水漂洗,置于用生理鹽水配制的 Hoechst 33258(濃度為50ul/ml)中染色10min,熒光染料將支原體內(nèi)的DNA著色,染色后用蒸餾水洗1~2min,滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴,然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下散于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)為支原體。

c. 電鏡檢查。制備電鏡標(biāo)本,用掃描電鏡或透射電鏡觀察。

d. DNA分子雜交檢查。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,檢出率高,但方法較復(fù)雜。

e. PCR。現(xiàn)有支原體PCR檢測(cè)試劑盒銷售,可按說(shuō)明書檢測(cè)支原體污染。

3.2處理建議

支原體污染十分麻煩,若細(xì)胞已受支原體污染,最佳的處理方式是將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄,以免污染其它潔凈的細(xì)胞株,培養(yǎng)箱的其他細(xì)胞可用支原體抑制培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2代,以作預(yù)防,并使用支原體環(huán)境消毒試劑進(jìn)行環(huán)境消毒。

對(duì)于珍稀細(xì)胞

1)采用支原體抑制試劑處理細(xì)胞,根據(jù)相關(guān)指南使用,周期結(jié)束后可以進(jìn)行鑒定。

2)清洗純化法,由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過(guò)反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使?jié)撛谥гw數(shù)量降低至極限,并結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用,可達(dá)到較好的效果,但極有可能無(wú)法根除;

3)支原體特異性血清:用5%的兔支原體免疫血清可抑制支原體生長(zhǎng),一般抗血清處理后11天即可轉(zhuǎn)為陰性。

4)巨噬細(xì)胞吞噬法:將巨噬細(xì)胞與被支原體污染細(xì)胞共培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中,為檢查支原體是否已被消除干凈,可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證,取出支持物逐日染色、鏡檢觀察,至支原體被消除干凈為止。

5)使用支原體抗體培養(yǎng)基,每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液,換液時(shí)用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞1~2次,保持適當(dāng)細(xì)胞密度;處理15天后,用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)支原體是否完全清除;

6)為避免細(xì)胞再次受到支原體污染,應(yīng)每隔1月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測(cè),以保證沒(méi)有新的支原體污染。

處理方法:若細(xì)胞狀態(tài)尚可,添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰;若細(xì)胞狀態(tài)很差,建議消殺后丟棄。

4. 黑膠蟲(chóng)污染

污染來(lái)源:可以穿透濾膜,也可以通過(guò)空氣傳播,低倍下為黑色點(diǎn)狀,高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去,培養(yǎng)液也是不渾的,一般不會(huì)太影響,細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多,且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化,可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響,在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失,除更換血清外無(wú)須特殊處理。

黑膠蟲(chóng)圖片

“黑膠蟲(chóng)”是一種常見(jiàn)的細(xì)胞污染物,暫無(wú)明確定義,可存在于動(dòng)物細(xì)胞,也可以生存于培養(yǎng)基中,隨細(xì)胞傳代而傳代,是一種異養(yǎng)物質(zhì),主要來(lái)源為血清。

4.1污染特征

培養(yǎng)液不渾濁,但在顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí),細(xì)胞周圍和培養(yǎng)液中有很多“小黑點(diǎn)”,且“黑膠蟲(chóng)”與細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān),隨著細(xì)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)“小黑點(diǎn)”逐漸增多,更換培養(yǎng)液或洗滌細(xì)胞不能將其去除;?

細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)消耗快,需要頻繁更換培養(yǎng)液;

細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞狀態(tài)差,空泡化嚴(yán)重,甚至還可能出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的改變。

“黑膠蟲(chóng)”與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng),嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4.2處理方式

對(duì)于黑膠蟲(chóng)污染的細(xì)胞,最快速有效的處理方式是使用黑膠蟲(chóng)清除劑,添加黑膠蟲(chóng)抑制劑/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰,同時(shí)確保培養(yǎng)體系中的血清必須為無(wú)黑膠蟲(chóng)污染的優(yōu)質(zhì)血清。非珍稀或污染嚴(yán)重細(xì)胞建議直接丟棄。

另外對(duì)培養(yǎng)箱做由里至外的清潔處理;

4.3預(yù)防措施

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,超凈臺(tái)用紫外燈照射30-60min,然后用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面,并開(kāi)啟超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)5-10min再開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作;

實(shí)驗(yàn)用品用75%酒精擦拭后才能放入超凈臺(tái)內(nèi);實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)移出超凈臺(tái),以利于空氣的流通;實(shí)驗(yàn)完成后用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面;

每次操作只處理一種細(xì)胞,即使不同細(xì)胞使用相同的培養(yǎng)基也不要共享同一瓶培養(yǎng)基,避免細(xì)胞間的交叉污染;

操作時(shí)小心取用無(wú)菌的物品,避免污染。勿碰觸吸管尖頭,不小心碰觸后應(yīng)立即更換;不要在打開(kāi)的容器瓶口正上方操作,容器打開(kāi)后,傾斜45°操作,操作完成后及時(shí)蓋上瓶蓋;

CO2培養(yǎng)箱的清潔是較易被忽視的地方,應(yīng)1-2個(gè)月對(duì)培養(yǎng)箱定期進(jìn)行清潔消毒。

先用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁、隔板、水盤2-3次,用雙蒸水清洗,再用酒精棉球擦拭一遍,最后紫外燈照射4h以上。水盤內(nèi)加入無(wú)菌水(應(yīng)每周更換),待培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、濕度、CO2濃度穩(wěn)定后再放入細(xì)胞;

定期清洗或更換超凈臺(tái)過(guò)濾膜、預(yù)濾網(wǎng)。

5.細(xì)胞交叉污染

特征:即不同的細(xì)胞混雜在一起

污染來(lái)源:細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi),往往會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞交叉污染。目前,已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。

鑒定方式:同種屬進(jìn)行STR鑒定,多等位基因數(shù)大于3個(gè)。(需考慮本身的遺傳背景,如EA.hy 926為融合細(xì)胞,本身就包含兩套遺傳信息);不同種屬進(jìn)行PCR法,對(duì)種屬特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增,不同種屬產(chǎn)物大小不同。

處理建議:建議重新引種。

預(yù)防建議:盡量避免多細(xì)胞同時(shí)操作,如傳代等;器具和培養(yǎng)溶液避免交叉使用。

污染防治策略

NO.1 細(xì)胞房環(huán)境控制

環(huán)境要求:潔凈區(qū)10000級(jí),局部100級(jí),定期進(jìn)行沉降菌檢測(cè)

環(huán)境消毒:每周一次定期消毒滅菌

a.地面/墻面:84消毒液、新潔爾滅交叉使用

b.環(huán)境消毒:定期紫外照射,臭氧熏蒸

c.儀器設(shè)備表面:75%酒精擦拭,培養(yǎng)箱、顯微鏡托盤等高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域需經(jīng)常清潔,培養(yǎng)箱水盤和復(fù)蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑

d.耗材消毒:需重復(fù)使用的耗材確保按照規(guī)定清洗、高溫高壓滅菌,使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進(jìn)超凈臺(tái),一周內(nèi)使用完畢,未使用完的,需重新滅菌再使用

NO.2 實(shí)驗(yàn)人員管理

著裝:著連體衣,戴口罩、手套,頭發(fā)、手腕等要包好,減少皮膚外露。

行為:減少走動(dòng),出入關(guān)門,操作時(shí)不要講話。

技能:養(yǎng)成良好的無(wú)菌操作習(xí)慣。

其他:減少共用物品,公共使用區(qū)域統(tǒng)一使用習(xí)慣,區(qū)分潔凈區(qū)域和有風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域。

細(xì)胞房規(guī)范操作流程

1)進(jìn)入細(xì)胞房前穿戴實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套及鞋套等,用消毒酒精擦拭雙手;

2)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:提前0.5~1h打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈進(jìn)行消毒,同時(shí)將足量所需試劑、耗材等放置于消毒窗口,打開(kāi)紫外燈進(jìn)行消毒。

3)按照個(gè)人習(xí)慣擺放試劑、耗材及儀器,切勿置于生物安全柜進(jìn)出風(fēng)口;

4)操作要準(zhǔn)確、敏捷、有序,盡量減少試劑和細(xì)胞瓶的敞口時(shí)間;專管專用,避免交叉污染;

5)操作完成后,將試劑放回原位;丟棄廢物和廢液;用酒精擦拭臺(tái)面進(jìn)行消毒;打開(kāi)超凈臺(tái)及細(xì)胞房紫外燈,至少照射15min進(jìn)行消毒。

6)定期清理建議

NO.3 實(shí)驗(yàn)用品管理

試劑:使用前確保無(wú)菌,自己配制的試劑需過(guò)濾除菌后再使用。

耗材:需要重復(fù)使用的耗材確保按照規(guī)定清洗、高溫高壓滅菌,使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進(jìn)超凈臺(tái),一周內(nèi)使用完畢,未使用完的,需重新滅菌再使用。

儀器設(shè)備:定期擦拭消毒,培養(yǎng)箱、顯微鏡托盤等高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域需經(jīng)常清潔,培養(yǎng)箱水盤和復(fù)蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑。

其他:當(dāng)出現(xiàn)培養(yǎng)物泄漏時(shí),應(yīng)及時(shí)清理干凈;出現(xiàn)局部污染時(shí),應(yīng)找出污染源并對(duì)環(huán)境整體消毒。

細(xì)胞污染類型常見(jiàn)問(wèn)題

1.如何判斷小黑點(diǎn)是污染還是碎片

細(xì)胞碎片或者分泌物

在細(xì)胞代謝過(guò)程中,細(xì)胞凋亡后會(huì)產(chǎn)生一些分泌物的沉積和碎片物質(zhì),在顯微鏡下呈黑點(diǎn)狀。

特征

細(xì)胞碎片大小不均一,會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間少量增多,但是不會(huì)呈倍增的趨勢(shì)增多;

細(xì)胞狀態(tài)差時(shí)碎片會(huì)較多,狀態(tài)變好后黑點(diǎn)減少;

細(xì)胞分泌物情況根據(jù)細(xì)胞有區(qū)別,有的細(xì)胞不產(chǎn)生分泌物,有的細(xì)胞會(huì)有較多的分泌物,往往是不影響細(xì)胞形態(tài)和增殖速度。

外源微生物污染

當(dāng)細(xì)胞被支原體、黑膠蟲(chóng)或者細(xì)菌污染時(shí),往往也會(huì)產(chǎn)生很多小黑點(diǎn),尤其是細(xì)菌污染的情況出現(xiàn)時(shí),這些小黑點(diǎn)甚至?xí)?dǎo)致培養(yǎng)液渾濁。

如何區(qū)分是否為污染

外源微生物污染

支原體和黑膠蟲(chóng)污染一般表現(xiàn)為黑點(diǎn)增多并伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢、死細(xì)胞增多等現(xiàn)象,通常加入對(duì)應(yīng)清除試劑后細(xì)胞狀態(tài)會(huì)有顯著改善。

細(xì)胞分泌物/細(xì)胞碎片

細(xì)胞分泌物和細(xì)胞碎片則不會(huì)因?yàn)榧尤肭宄噭┖蠖纳?,?huì)持續(xù)存在且不影響細(xì)胞增長(zhǎng)。

細(xì)胞污染后的處置

細(xì)胞一旦發(fā)現(xiàn)有污染出現(xiàn),應(yīng)及時(shí)對(duì)所用試劑和耗材進(jìn)行清理。耗材可更換新的或者重新高壓滅菌,試劑可重新過(guò)濾除菌或者更換新批次,操作臺(tái)和細(xì)胞房需用消毒液進(jìn)行全面清潔消殺后方可復(fù)蘇新的細(xì)胞,以免反復(fù)出現(xiàn)污染。

2.在細(xì)胞培養(yǎng)液中,有種可以游動(dòng)的蟲(chóng)子是什么污染?

是細(xì)菌污染。帶鞭毛的細(xì)菌就是會(huì)游動(dòng)的。

3.有很多黑點(diǎn),在原位顫抖,沒(méi)那么明顯的定向運(yùn)動(dòng),是什么污染?

細(xì)胞碎片、血清沉淀和有些細(xì)菌污染,都會(huì)在原位顫抖。前者是原地做不規(guī)律的布朗運(yùn)動(dòng),細(xì)菌是原地轉(zhuǎn)動(dòng),頻率會(huì)高很多。

4.血清的絮狀物雜質(zhì)屬于正?,F(xiàn)象嗎?

血清里面有一些大分子蛋白和一些纖維析出,呈現(xiàn)絮狀,也有一些磷酸鈣析出呈現(xiàn)小黑點(diǎn),這些都是很常見(jiàn)的。沉淀太多,可以離心去掉部分。血清沉淀的多少也跟血清的溶解方式有關(guān),溶解過(guò)程中最好是4℃,期間不時(shí)搖晃進(jìn)行溶解。根據(jù)普諾賽多年培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)驗(yàn),血清的沉淀多與少并不決定血清質(zhì)量。

5.液體變微黃、渾濁怎么解決?

這個(gè)是典型的細(xì)菌污染。如果細(xì)胞形態(tài)尚且完整,可以嘗試用10%的雙抗清洗去除,或者使用別的抗生素清除,如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等;如果細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)很差,就沒(méi)有挽救的價(jià)值了。

6.為什么有的培養(yǎng)基天天需要換液呢?

正常情況下,是不需要每天換液的。培養(yǎng)基橘黃色是細(xì)胞比較喜歡的環(huán)境,正常是2~3天換一次比較好,換液多了細(xì)胞狀態(tài)反而容易受影響。如果是因?yàn)榕囵B(yǎng)基異常消耗,才需要每天換液,那么我們要做的是找到異常消耗的原因,是細(xì)胞量過(guò)多,還是有其他細(xì)菌或者支原體污染。先找到原因才能不用每天換液。

7.凍存的細(xì)胞,每次復(fù)蘇養(yǎng)幾天就污染了,是什么原因呢?

如果凍存前就帶進(jìn)去了污染,那么同一批次的復(fù)蘇出來(lái)都會(huì)有污染。這種情況下,可以在復(fù)蘇當(dāng)天給予抗生素清除(不能用雙抗),如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等;如果同一批有復(fù)蘇沒(méi)有污染的情況,要考慮復(fù)蘇過(guò)程,建議換一下水浴鍋的水和其他試劑耗材再?gòu)?fù)蘇。

8.細(xì)胞培養(yǎng)不生長(zhǎng),傳代擴(kuò)不起來(lái),是不是就是支原體污染?

支原體污染肉眼是很難區(qū)分的,支原體污染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差,但是細(xì)胞狀態(tài)變差并不是都是支原體造成的,所以我們還是要用支原體檢測(cè)加以區(qū)分。

9.培養(yǎng)基污染以后,可以過(guò)濾一下繼續(xù)使用嗎?

不建議繼續(xù)使用。培養(yǎng)基里面可能會(huì)有殘留的細(xì)菌分泌物,比如內(nèi)毒素等,可能會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

10.培養(yǎng)箱水盤用什么抑菌劑?

傳統(tǒng)方法用硫酸銅,但是硫酸銅屬于重金屬,還是有一定的毒性的。建議使用水浴鍋安全衛(wèi)士,安全無(wú)毒,可以持續(xù)一周無(wú)菌狀態(tài)。

11.試劑已經(jīng)全部換新的了,還是一直污染,是什么原因?

如果試劑盒耗材全部更換了,還需要排除下凍存前是否有污染。再就是是否存在操作問(wèn)題,可考慮換其他人養(yǎng)一下試試。

12.懸浮細(xì)胞碎片形成的黃團(tuán)怎么處理呢?

懸浮細(xì)胞碎片形成的黃團(tuán)可以通過(guò)低速離心去除,前提是細(xì)胞量一定要夠多,轉(zhuǎn)速一般可以降低到800rpm左右。離心完上清別急著丟,先看下細(xì)胞是否已經(jīng)離心下來(lái),也可以根據(jù)細(xì)胞大小調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速。

13.細(xì)胞里面有一些小方塊一樣的東西,是什么原因?

小方塊一般是結(jié)晶類的??梢韵扔门囵B(yǎng)基或者PBS稀釋溶解后換液,看有沒(méi)有改善。

14.放了五個(gè)月的完全培養(yǎng)基,出現(xiàn)絮狀懸浮物,但是觀察不是細(xì)菌,可以過(guò)濾后加點(diǎn)血清繼續(xù)使用嗎?

不建議繼續(xù)使用。絮狀物首先要排除霉菌類的污染;即使排除了霉菌,完培產(chǎn)生絮狀物析出了,也會(huì)對(duì)成分有一定的影響,影響后期培養(yǎng)細(xì)胞。

15.飼養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,如果觀察有沒(méi)有污染,大概要在多大倍鏡下觀看?

觀察污染的話400倍鏡就夠了,10X目鏡加40X物鏡。

16.請(qǐng)問(wèn)貼壁細(xì)胞表面有白膜,培養(yǎng)液惡臭,是什么原因?qū)е碌奈廴?

有白膜和惡臭應(yīng)該是有污染無(wú)疑了,還很嚴(yán)重,具體是細(xì)菌還是真菌,要結(jié)合顯微鏡下的菌體形態(tài)來(lái)進(jìn)一步區(qū)分。

17.細(xì)胞污染后,用10倍雙抗處理后,沒(méi)有再長(zhǎng),這時(shí)細(xì)胞可以凍存嗎?

細(xì)菌不再生長(zhǎng),恢復(fù)正常1%抗生素后一周內(nèi)沒(méi)有再長(zhǎng)起來(lái),就是清除干凈了,可以凍存。

18.孵箱中一瓶細(xì)胞有黑膠蟲(chóng)污染,慢慢地整個(gè)孵箱都有污染了,那孵箱怎么打掃?

把細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移走,再用消毒液把培養(yǎng)箱全部擦拭一遍;培養(yǎng)箱水一定要清理干凈;培養(yǎng)箱角落和表面都噴上細(xì)胞房衛(wèi)士,關(guān)閉培養(yǎng)箱保持30分鐘,再打開(kāi)散氣30分鐘,換上干凈的無(wú)菌水就行了。

19.請(qǐng)問(wèn)培養(yǎng)箱滅菌水多久換一次呢?換的時(shí)候每次都要90℃滅菌么?

水浴鍋的滅菌水不加抑菌劑的話,建議是每次復(fù)蘇前都更換新的;加了水浴鍋安全衛(wèi)士,可以一周換一次,水是121℃滅菌20分鐘。

20.液氮有沒(méi)有可能污染?

理論上液氮這種極端的環(huán)境里,是不會(huì)有生物存活的,細(xì)菌凍存也是需要保護(hù)劑的。

21.新復(fù)蘇的細(xì)胞,一天后正常貼壁,但是培養(yǎng)液里懸浮大量的黑色團(tuán)塊,是什么原因呢?

可能是有細(xì)菌污染了,還是要結(jié)合顯微鏡下的黑團(tuán)形態(tài)來(lái)進(jìn)一步確診。

為了防止發(fā)生污染,預(yù)防是第一位的,而且要注意實(shí)驗(yàn)規(guī)范,盡量做到定期消毒,實(shí)驗(yàn)人員也要有防止污染發(fā)生的意識(shí),遇到發(fā)生污染情況可運(yùn)用上述的鑒定和去除方法,不過(guò)一切的去除方法都不如一個(gè)眾所周知的習(xí)慣——保存無(wú)污染的細(xì)胞株,這才是最明智的做法。

規(guī)范操作是避免污染的最有效方式。細(xì)胞培養(yǎng)間配備槍式移液器、手術(shù)器械、離心機(jī)、冰箱等專用儀器設(shè)備以及專用的實(shí)驗(yàn)服和拖鞋,并定期消毒。專用物品只在培養(yǎng)間內(nèi)使用,不得帶出細(xì)胞房。無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞。必要物品可暫時(shí)放置,其他實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出,以利于氣流的通暢。培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中使用的所有實(shí)驗(yàn)用具,如移液管、一次性槍頭、一次性塑料離心管、凍存管等需121°C高壓滅菌20分鐘后烤干備用,一些玻璃器皿如細(xì)胞培養(yǎng)瓶等須先泡酸、洗凈、晾干后再高壓滅菌。

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